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最全的液相色谱柱知识分享和选择技巧,你值得拥有!参数、正反相对比、选择等一手掌握!

2017-07-31 15:45:43  来源: 检测家

现代高效液相色谱分析中,色谱柱的选择直接影响了分离效果的好坏,选择合适的色谱柱可以缩短方法开发所需的时间,并且使方法更具稳定性。但是现在市场上色谱柱种类繁多,不同类型的色谱柱分离对象不同,因此,要做合适的选择,必须对此有一定的认识和了解。


色谱柱参数


物理性质


柱长,内径,如250*4.6mm。一般柱长在2—250mm,柱越长,分离度越高,但柱压更高,分离所需时间更长;但分离度与理论塔板数的平方根成正比,所以一昧增加柱长并不是最有效的分离手段,一般情况下,150mm、5um的填料可以提供足够的塔板数。 


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粒径,影响色谱分离度。粒径越小,分离越快,柱效越高,但柱压力越高,柱容易被污染,导致柱寿命降低。常见分析柱通常使用5um填料,复杂的多组分样品分离一般使用3.5um粒径,更大内径的制备色谱柱通常使用更大的粒径。如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3.5um的色谱柱的背压却是5um的2倍,因此如何选择填料粒径需要根据现实情况而定。


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孔径,60A,120A,300A等。孔径小,则含孔率高,比表面积大,载碳量高;色谱柱填料孔径大小需和分子大小相匹配,保证分子自由进出填料孔并与孔内表面的键合相进行分离分配,通常要求孔径直径是分子直径的3倍以上,一般小分子使用80—120A,大分子使用300A。


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颗粒形状,一般有球形和不规则形,当使用黏度较大的流动相时,球形颗粒可以降低柱压,延长色谱柱寿命。


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比表面积,指的是每克填料的表面积,如180m2/g—350m2/g,与粒度和含孔率有关;比表面积大,会增加样品与键合相之间的反应,增加保留和分离度;比表面积小则可以缩短分析时间和平衡时间,并不是比表面积大或者小就更好,需要选择合适的比表面积。

化学性质:


硅胶基质:最通用的基质,强度大,化学修饰容易,但使用的pH值范围有限(一般为2—8,特殊修饰的可以达到1—12)。


聚合物基质:多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂,化学稳定,应用pH范围宽,具有更强的疏水性,对蛋白质等样品分离效果较好;但强度较小,有机溶剂可能导致聚合物溶胀而受损,批次重复性较差,商品化色谱柱不多,一般价格较贵。


载碳量:基质表面键合相的比例,载碳量高,则保留增加,适合分析非极性化合物。


键合相:键合试剂不同,对化合物的选择性不同,一般长链的烷基键合相(C18 C8)比短链的(C4 C3)稳定;非极性的键合相比极性的键合相(-NH2)稳定。


封端:用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,以减少残留的硅醇基,减轻待测组分与酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象。尤其对于极性样品而言,未封端处理的色谱柱分离效果较差。


正相&反相色谱


目前市场上主要以反相色谱为主,约占80%的比例。


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在了解了色谱柱的基本知识后,色谱柱的选择也就迎刃而解了。


柱长及内径的选择


长度的选择:柱越长,总柱效越高(n值越大),柱越长,分析时间也越长。250—300mm是最普遍的柱长,实验室一半以上的工作都是采用此规格柱子,一般用来分离l0到50个组份的中等至复杂混合物;500—600mm,要求较高分辨率的应用,—般用来分离大于50个组份或包含有难分离物质的复杂样品程序升温分析。


内径:柱效率与柱半径平方成反比,内径越小柱效越高,但内径越大,柱容量也增加,允许进样量就越多。当进样量超过柱容量时,则因柱内每块理论板内不能建立真正的平衡,将会导致色谱蜂畸变,柱分辨率降低,重现性不好。因此对于复杂样品需要精确分离,必须使用小内径柱子。另一方面若样品中存在具有很不相同浓度组份化合物,为了增加样品容量就必须使用内径大的柱子,目前实验室使用最常见的柱子内径一般是4.6mm。


一般选择原则:分析大分子量化合物选择大孔径色谱柱;对于高pH值或者碱性化合物需要选择高封端或者特殊封端的色谱柱,以改善峰形,延长色谱柱使用寿命等。


现在商品化的液相色谱柱琳琅满目,根据色谱柱的参数可以给我们提供一个初步的选择,但由于各个仪器厂商的填料技术和键合技术都有差异,即使都是C18柱,同一品牌不同系列都有不同的功能,有能耐受低pH值的、有耐高温的、有适合碱性样品的等等。所以在选择色谱柱前要好好研究色谱柱参数,仔细阅读色谱柱说明书,才能找到合适的色谱柱和适宜的分离方法。


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