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液相色谱见“鬼”了?工程师带你盘点液相色谱鬼峰原因及解决方案

2017-10-26 16:25:25  来源: 检测家

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  鬼峰是液相色谱中最常出现的问题之一,鬼峰来源多种多样,理论上讲,在HPLC系统中任何一个节点均有可能引入鬼峰,依据鬼峰出现的频率,其主要来源于溶剂问题,仪器问题、流动相残留气泡以及操作不当等。主要分为以下几种情况 :


1.溶剂问题 


a有机溶剂 

  甲醇制备工艺相对乙腈来说较为简单,杂质含量也较少。但是由于甲醇紫外吸收范围比乙腈广,所以当使用紫外检测器时,尤其是波长较低时,尽量使用乙腈作为有机相,用甲醇的话漂移太大。而用作梯度色谱的乙腈质量要求较高,一般用进口梯度色谱专用乙腈能够很好的减少鬼峰的出现。 另外如果有机相使用完后未更换新的流动相瓶,而是采用直接添加补充的方式也有可能会产出鬼峰。


b水 

  很多单位用自制蒸馏水作为水相,但是结果并不是很好。原因就是一些低沸点的有机杂质并不能够通过蒸馏除掉。有条件的尽量用HPLC级的纯水,没有条件的也可用娃哈哈或是屈臣氏等水代替,但是如果色谱条件比较严格也是有可能出问题的。 此外,水相要现配现用,避免微生物滋长。


c其它试剂 

  缓冲盐、TFA、EDTA等试剂也会对流动相造成很大的影响,尽量用纯度高的试剂配制流动相。


2.仪器问题


a液相的流动相管路被污染 

  长时间的使用含水量较高的流动相(尤其是加入缓冲盐的),细菌就容易在管路中滋生,细菌的代谢产物或是细胞碎片能造成鬼峰。


b检测器样品残留 

  多为一些样品组分在检测器流通池内的残留,其特点具有先后针之间的重复性差,或者没有重复性,色谱峰峰形特别尖锐类似大的毛刺。该种情形下,需要对流通池特别是石英视窗进行彻底清洗(联系工程师或者严格按照manual进行)


c单向阀堵塞 

  造成系统压力不稳,从而产生鬼峰。早期岛津的液相单向阀貌似不能用纯乙腈作为流动相,现在应该已经得到改进。  


d色谱柱中组分残留 

  色谱柱可对流动相或系统流路内的强保留污染组分起到富集作用,在有机相比例随梯度程序变化的过程中而被冲洗出来。在使用较长的色谱柱的时候尤其值得关注,因此,在水相不确定是否有杂质存在的条件下,梯度运行后的再平衡时间尽可能的短,一般以10倍柱体积为宜。


3.流动相残留气泡


  保留时间一般不可重现,即使流路中气泡连续存在,鬼峰出现的位置亦不可预测。可将流动相超声或鼓He脱除气泡并打开purge阀,大流速冲出仪器管路中的气泡,来减少气泡引起的鬼峰现象。


a在线脱气机脱气不完全 

 a在线脱气机脱气不完全。


b两种流动相的有机相比例相差太大 

  例如A为100%水,B为100%乙腈。在梯度条件允许的情况下尽量减少两中流动相之间的差距,降低空气在两中流动相中溶解度的差异,从而减少气泡的产生。 


c流动相配置好后预先超声脱气 

  c流动相配置好后预先超声脱气。


4.操作问题 


a流动相配置过程中受到污染 

  盛放流动相的容器或是样品瓶受到污染:这种污染可能来自于洗涤剂、铬酸洗液或是其他实验人员用完后的残留杂质。流动相容器的清洗一般用干净的水+有机溶剂涮洗就行,过多的清洗步骤反而可能造成二次污染。有时流动相容器的塑料盖碎片都有可能是杂质的来源。对于样品瓶污染情况下的鬼峰,容易排除,仅需要分别将样品溶解或稀释用的试剂以及进样小瓶更换,即可确定鬼峰的来源。

pH计:很多pH计以聚碳酸酯作为外壳,然而聚碳酸酯是可以溶于有机溶剂的,所以尽量使用玻璃pH计来测量流动相的pH。

滤膜:劣质的或者型号错误的滤膜往往是鬼峰出现的原因。

放置时间过长:流动相在空气中暴露时间过长,就可能吸收空气中的有机杂质,有时流动相中的添加剂,例如TFA,时间长了会氧化从而产生杂质。

  由自动进样器引入的鬼峰:自动进样器在进样之后,部分样品溶液残留在进样针头以及针座之上,对下次进样别的样品的结果产生干扰,出现鬼峰。对于一些强吸附性组分,尽管进行程序洗针,有时依然可能会引入鬼峰。针对这种情形,可在仪器平衡之后,分别进样不同试剂的Blank以及不进样,比较得到的图谱,基本可确定鬼峰是否来源于进样过程。


b样品稀释液与流动相极性或者pH相差太大 

  这也是导致鬼峰的原因之一,这种问题很有可能导致样品分为两个不同的阶段出峰,从而产生双峰或者多峰。

鬼峰对于反相液相色谱来说,是经常遇到的问题,对分析方法造成干扰并影响分析结果的准确性。从上面的讨论可以看出,尽管鬼峰的来源多种多样,基本应对原则就是,找到鬼峰的来源,更换流动相或更换添加剂或对仪器被污染部分进行清洗,在实验中避免不正确的操作。


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