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高效液相色谱劈叉峰问题排查---溶剂效应【七嘴八舌聊实验】

2017-12-20 09:54:35  来源: 检测家

近期使用高效液相色谱建立方法的过程中,遇到目标物呈现劈叉峰问题,经过查阅资料、咨询售后工程师以及不断尝试,最终问题得以解决,现将问题解决过程分享给大家,希望大家在今后工作中遇到相似的问题时能够少走一些弯路。


1.问题发现及猜想验证


发现:使用95%乙醇作为溶剂溶解样品,并以甲醇/水为60/40为流动相时,测试结果发现目标峰为劈叉峰。


微信图片_20171219173414.jpg


猜想:是否存在该流动相梯度下两种物质没有分离开的情况?


验证:将流动相甲醇/水比例调到50/50、40/60、30/70(该比例流动相的洗脱能力已经很弱,故没有继续向低比例尝试)。然而结果并没有如我们所想,双峰发生分离。因此想办法去验证其是否为一种物质?


进一步验证:比对一下两个劈叉峰的紫外吸收波谱,如两个劈叉峰具有相同的特征吸收,则表明其是一种物质。结果表明,两个劈叉峰具有相同的特征吸收,也就是说两个劈叉峰是一种物质(看到这样的结果再想想之前所做系列测试,心里真是既欢喜又有点小忧伤),不过确实验证了此为一种物质,接下来就是查找原因及优化峰形了。


2.查找劈叉峰出现原因


猜想:因为当样品使用非流动相溶解样品时,样品在进入色谱柱之前,会首先富集在色谱柱前端,然后才会被流动相快速洗脱,此时,样品的溶剂在柱内可看做流动相的一部分,当样品的溶剂洗脱能力大于流动相时,样品的溶剂带在色谱柱中迁移更快,有些样品分子溶解在强溶剂中,并随强溶剂流过柱子,而有些则溶解在流动相中,因此致使这些分子通过色谱柱的速度发生变化,使峰形扭曲,发生变形。据此,猜想是否是溶剂效应导致的峰展宽、峰劈叉现象?


验证:改变样品溶剂比例,观察峰形变化。因此分别使用60%、70%、80%、90%乙醇作为样品溶剂,继续进行试验,试验结果(图2)表明,样品溶剂较弱时会使样品在色谱柱上发生浓缩,色谱峰通常情况下会比使用较强溶剂时窄一些,并且不会出现峰劈叉现象。到此也就查明了出现该现象的原因,下面当然就是解决问题了。


微信图片_20171219173434.jpg


3.问题解决及验证


猜想:既然是溶剂效应导致的,而解决溶剂效应最好的办法应该就是使用流动相作为样品的溶剂,但是因本方法受法规限制只能使用95%乙醇作为食品模拟液,因此只能减小进样体积了,当进样体积足够小时,样品的稀释过程会非常快,溶剂效应的程度也会有所降低。


验证:调整进样体积为5μL、2μL、1μL进行测试(之前为10μL)。果不出所料,问题解决了,进样体积为1μL时,劈叉峰消失。


4.总结


较低的进样体积固然可以降低溶剂效应,但是考虑到样品浓度较低或者一些样品制备或提取过程中的技术限制,较小的进样可能会受到检出限等要求的限制。因此,最佳的方法选择合适的样品溶剂,例如本实验,虽然迁移实验条件不可改变,但是,我们可以将样品浓缩富集后再使用流动相溶解的方式避免溶剂效应的发生。


本人将此次发现的问题及解决的方法特汇总出来,仅希望大家在今后工作中遇到相似的问题时能够少走一些弯路。仪器使用及问题分析的过程中受本人能力及阅历的局限,可能存在许多披露或者错误,若有不当之处,望大家指正交流。


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